產品描述
 

過氧化物酶POD (EC 1.11.1.7)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。本試劑盒檢測原理是：POD催化H₂O₂氧化成特定底物，在470 nm有特征光吸收。本試劑盒可以檢測細胞或組織勻漿液上清、血清等多種生物樣品中的POD活性。按照試劑盒提供使用步驟操作，1個試劑盒可供50次檢測。

 

產品組分

 

組分編號	組分名稱	組分規格
50106-A	Extraction Buffer 提取液	60 mL×1
50106-B	Solution I 試劑一	60 mL×1
50106-C	Solution II 試劑二	0.33 mL×2
50105-D	Solution III 試劑三	10 mL×1

 

運輸和保存方法

 

冰袋運輸。 4 ℃保存，有效期6個月。

 

注意事項

 

1）待測樣品不能含有酶抑制劑，同時避免反復凍融導致POD失活。

2）實驗前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

4）本產品僅作科研用途！

 

需自備的儀器和用品

 

可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

 

使用方法

 

1．樣品制備

① 細胞或細菌樣品

細菌或培養細胞：收集細菌或細胞到離心管中，500g 4℃離心5 min后棄上清；按照細菌或細胞數量(10⁴)：提取液體積(mL)為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1 mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3 s，間隔10 s，重復30次）；8000g 4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。

② 組織樣品

按照組織質量(g)：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1 mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

【注】：對于質地堅硬的植物樣本，可液氮研磨后再加入提取液，冰浴勻漿后離心取上清待測。

③ 血清（漿）樣本：直接檢測。

2. 測試步驟

① 分光光度計預熱30 min以上，調節波長至470 nm，蒸餾水調零。

② 試劑二工作液的配制，實驗時每瓶試劑二加入5 mL試劑一混勻備用，配制好的工作液可4 ℃保存一周，但建議盡量現配現用。

③ 測定前將試劑一、二和三在37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置10 min。

④ 按操作表依次加入各試劑：

試劑名稱	測定管(μL)	對照管(μL)
樣本	15	0
蒸餾水	270	285
試劑一	520	520
試劑二	130	130
試劑三	135	135

在1 mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，記錄470 nm 下30s 時的吸光值A1和1min30s后的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。

【注】：1. 若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液，在37℃（哺乳動物）或25℃（其

它物種）放置10 min以上，測定時加入15 µL樣本和1055 µL混合液測定。2. 如果ΔA小于0.005，可將反應時間延長到 5min。如果ΔA大于0.5或者反應液中有較多氣泡產生，可將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中乘以相應稀釋倍數。

3. POD 活性計算

① 血清（漿）POD活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每分鐘A470值變化0.01為一個酶活力單位。

計算公式：

POD (U/mL)= ΔA×V_反總÷V_樣÷0.01÷T = 7133×ΔA

② 組織、細菌或細胞POD活性

a. 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘 A470值變化0.01為一個酶活力單位。

POD (U/mg prot) = ΔA×V_反總÷(V_樣×Cpr)÷0.01÷T = 7133×ΔA÷Cpr

b. 按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A470值變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）= ΔA×V_反總÷(W×V_樣÷V_樣總)÷0.01÷T = 7133×ΔA÷W

c. 按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A470值變化0.01為一個酶活力單位。

POD (U/10⁴ cell) = ΔA×V_反總÷(500×V_樣÷V_樣總)÷0.01÷T = 14.27×ΔA

V_反總：反應體系總體積，1.07 mL； V_樣：加入樣本體積，0.015 mL；V_樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

HB220815