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Hifair? IV Reverse Transcriptase (200 U/μL)

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詳細介紹

 

Hifair® IV Reverse Transcriptase是Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上通過基因工程技術(shù)得到的全新逆轉(zhuǎn)錄酶,與Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase相比,其熱穩(wěn)定性大幅度提高,可耐受60℃,適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時,該酶增強了與模板的親和力,適合低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄和mRNA文庫構(gòu)建。Hifair® IV Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升,可擴增長達10 kb的cDNA

 

產(chǎn)品組分

編號

組分

產(chǎn)品編號/規(guī)格

11112ES92 (10000 U)

11112ES93 (10000 U)

11112-A

5×Hifair® IV Buffer

250 μL

1200 μL

11112-B

Hifair® IV Reverse Transcriptase (200 U/μL)

50 μL

250 μL

 

產(chǎn)品應(yīng)用

全長cDNA文庫構(gòu)建;終點法PCR;實時定量PCR等。

 

活性定義

Poly(A) .Oligo(dT)為模板-引物,在37℃,10 min內(nèi),將1 nmol的dTTP摻入為酸不溶性物質(zhì)所需要的酶量定義為1個活性單位(U)。

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20ºC保存,有效期一年。

 

注意事項

1)請保持實驗區(qū)域潔凈;操作時需穿戴干凈的手套、口罩;實驗所用耗材均需保證RNase free,以防止RNase污染;

2)所有操作均應(yīng)在冰上進行,防止發(fā)生RNA降解;

3)為保證逆轉(zhuǎn)錄成功,建議使用高質(zhì)量的RNA樣本;

4)為了您的安全和健康,請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

5)本產(chǎn)品僅做科研用途!

 

第一鏈cDNA合成操作步驟

1. RNA變性(此步為可選步驟,RNA變性有助于打開二級結(jié)構(gòu),可在很大程度上提高第一鏈cDNA的產(chǎn)量。)

組分

使用量

RNase free ddH2O

to 13 μL

Oligo (dT)18 (50 μM)

or Random Primers (50 μM)  

or Gene Specific Primers(2 μM)

1 μL

or 1 μL

or 1 μL

模板RNA

Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:1 pg-500 ng

65℃加熱5 min,迅速置于冰上冷卻2 min。簡短離心收集反應(yīng)液后加入下表中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,并用移液器輕輕吹打混勻。

2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制

組分

使用量

上一步的反應(yīng)液

13 μL

5×Hifair® IV Buffer

4 μL

dNTP Mix(10 mM)

1 μL

Hifair® IV Reverse Transcriptase (200 U/μL)

1 μL

RNase Inhibitor (40 U/µL)

1 μL

3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置

溫度

時間

25℃

5 min

50℃

15 min

85℃

5 min

【注】:1)當(dāng)使用Random Primers時,需25℃,孵育5 min;若使用Oligo (dT)18Gene Specific Primers,此步可省略;

2)逆轉(zhuǎn)錄溫度:推薦使用50℃。對于GC含量模板或者復(fù)雜模板,可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到55℃-60℃;

3)85℃加熱5 min,目的是使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。

※ 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于后續(xù)PCR或qPCR反應(yīng),也可-20℃短期保存,若需長期保存,建議分裝后,于-80℃保存,避免反復(fù)凍融。

HB221229

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