MolPure^® Plasmid Mini Kit 采用 MolPure^® DNA Column P3 和新型的溶液體系，使用常規堿裂解法分離質粒 DNA。提取過程中不需要用到有毒的酚氯仿等有機物抽提，也不需要用到耗時的異丙醇或乙醇沉淀。試劑盒內的 MolPure^® DNA Column P3 可特異性吸附質粒 DNA，不吸附蛋白質、多糖和其它非核酸類物質，具有高效、快速、方便等特點。提取到的質粒 DNA 純度高，可直接用于后續酶切、轉化、測序等實驗。

試劑盒組分

運輸和保存方法

Part I 組分冰袋運輸，-20℃保存；Part II 組分常溫運輸，室溫保存。產品有效期 12 個月。

注意事項

1. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH 值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

2. 注意觀察各溶液是否有析出或渾濁（尤其冬季等室溫為低溫環境時），可 37℃溫浴復溶至溶液澄清，避免影響使用效果。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

4. 本產品僅作科研用途！
 

實驗前準備

1.   自備設備和試劑：臺式離心機、振蕩儀、水浴鍋或金屬浴，無水乙醇，離心管等。

2.   除特殊指明外，所有的離心步驟均在室溫完成，使用可以達到 13,000 rpm 轉速的傳統臺式離心機。

3.   首次使用前，將 RNase A (10 mg/mL) （19001-A）加入緩沖液 RS^*（19001-B）瓶中，充分混勻后使用，并做好標記。每次使用后置于 4℃保存。若長期不用，置于-20℃保存。

4.   首次使用前，漂洗液 W^*（19001-I）和去蛋白液 PL^*（19001-H）需要加入無水乙醇（5T/50T/200T漂洗液 W^*分別加入5.2 mL/52mL/200mL無水乙醇；5T/50T/200T去蛋白液 PL^*分別加入1mL/10mL/40mL無水乙醇），充分混勻后使用，并做好標記。

操作方法

一、樣本預處理：

1. 取 1.5-4.5 mL 過夜培養的菌液，12,000 rpm 離心 30 s，棄掉上清液，收集菌體。

【注】：對于低拷貝質粒或＞10 kb 的質粒，建議適當加大菌體量，并等比例增加緩沖液 RS*、裂解液 LB 及結合液 BD 用量。

2. 加入 250 µL 緩沖液 RS^*，吹打或渦旋重懸菌體沉淀。

【注】：確保菌體徹底重懸。

【注】：確保緩沖液 RS^*中已添加 RNase A。

3. 加入 250 µL 裂解液 LB，溫和上下翻轉 6-8 次以充分裂解菌體，室溫放置 4 min。

【注】：此步驟不宜超過 5 min。

【注】：菌體裂解應溫和進行，避免造成基因組 DNA 剪切斷裂。

【注】：裂解后的菌液應清亮粘稠。若出現渾濁，可能為菌體裂解不徹底，可考慮減少菌體使用量。

4. 加入 350 µL 結合液 BD，立即溫和上下翻轉 6-8 次充分混勻。室溫放置 2 min。13,000 rpm 離心 10 min，小心收集上清。

【注】：加入結合液 BD 后立即混勻，以免出現局部沉淀。

二、質粒 DNA 提取：

1. 向 DNA 吸附柱 P3 中加入 100 µL 緩沖液 AC，13,000 rpm 離心 1 min，棄掉廢液。

【注】：處理后的 DNA 吸附柱 P3 僅限當天使用。

2. 將 DNA 吸附柱 P3 套入 2 mL 收集管中，備用。

3. 將上述上清液加入到 DNA 吸附柱 P3 中，12,000 rpm 離心 1 min，棄掉廢液。

【注】：混合液每次最大加入體積 700 µL，可分多次離心。

4.（選做） 加入 500 µL 去蛋白液 PL^*，12,000 rpm 離心 1 min，棄廢液。

【注】：確保去蛋白液 PL^*已添加無水乙醇。

【注】：此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質。

5.     將 DNA 吸附柱 P3 放回收集管，加入 600 µL 漂洗液 W^*，12,000 rpm 室溫離心 30 s，棄廢液。

【注】：確保漂洗液 W^*已添加無水乙醇。

6.     重復一遍步驟 5。

7.     將 DNA 吸附柱 P3 放回收集管，空柱 13,000 rpm 室溫離心 2 min，以除去殘留的漂洗液 W^*。

8.     將 DNA 吸附柱 P3 放入新的 1.5 mL 離心管中（自備），在DNA 吸附柱 P3 中央加入 50-100 µL 洗脫液，室溫放置 2 min。然后 12,000 rpm 離心 1 min。收集濾液，即為質粒DNA 溶液。

【注】：可通過以下方式提高回收產量：①70℃預熱洗脫液；②將 DNA 濾液再次上柱，室溫放置 2 min 后，洗脫。

9.     質粒 DNA 溶液可置于-20℃長期保存。

HB220719